Op het lab

Op deze pagina kun je zien wat we allemaal op het laboratorium hebben gedaan. Dit zijn de experimenten waar we ons mee bezig hebben gehouden, wat voor technieken er gebruikt zijn technieken en wat theorie om de technieken uit te leggen.

Het kweken van de bacteriën

Er zijn tandplak monsters afgenomen aan het begin en aan het einde van de interventiestudie. Deze monsters zijn bij alle proef patiënten op dezelfde plaats in het gebit afgenomen. Dit hebben we namelijk bij tand 3.6 (zie plaatje) gedaan. Omdat het tandplak niet zo uitgesmeerd kan worden op een voedingsbodem is deze in een epje gedaan met fysiologisch zout. Nadat hiervan de oplossing was gemaakt zijn deze monsters uitgesmeerd op verschillende platen.

Bloedagar

De bloedplaat is een verrijkt bacterieel groeimedium. Deze plaat wordt gebruikt voor veeleisende organismen zoals Streptokokken die niet op een gewoon medium groeien. Door de 5% toevoeging van schapenbloed wordt deze groei wel gestimuleerd. Deze plaat kan ook omgezet worden in een chocolate platen. Dit komt door verhitting waardoor het bloed gelyseerd word en zo evt. remmers inactiveert. Deze plaat zal gebruikt worden om een anaerobe en een aerobe verdunningsreeks van de genomen monsters op te kweken.

MRS agar

De MRS vormt een medium dat goede groei van lactobacilli ondersteunt. MRS agars en bouillons werden ontworpen om de groei van de melkzuurbacteriën te stimuleren. Deze bacteriën zijn Gram-positieve, katalase en oxidase negatief en zijn veeleisend in hun voedingsbehoeften. Lactobacilli zijn Microaërofiel en vereisen over het algemeen om in laagjes geplaat te worden voor aerobe teelt op vaste media. De kolonies kunnen in het medium of aan het oppervlak vormen en zijn compact en luchtig. Ook zijn de kolonies klein, ondoorzichtig en wit.

Bepalen welke bacterie er gevonden is

Na het opkweken van de monsters moet er uitgezocht worden welke bacteriën er nu eigenlijk in onze mond groeien. Dit doen we door middel van klassieke identificatie oftewel door middel van Biochemische testen. Dit zijn verschillende testen die onderscheid maken tussen bacteriën op basis van verschillende eigenschappen van de bacterie. Maar ook door middel van moderne identificatie dit gebeurt door middel van Moleculairbiologisch onderzoek. Hierbij wordt er onderscheid gemaakt op basis van de genetica van de bacterie.

Biochemische testen

Biochemische testen zijn testen die onderscheid maken tussen bacteriën op basis van wat ze wel en niet kunnen.

Gramkleuring

Om te beginnen wordt er een gramkleuring uitgevoerd. Hierbij wordt er een verschil gemaakt op basis van de celwand (Gram-Positief of Gram-negatief) en de vorm (een staaf of een kok) van de bacterie. Het verschil tussen Gram-positief en Gram-negatief is te onderscheiden aan de kleur van de cellen na Gramkleuring. De Gram-positieve bacteriecel geeft een paarse kleur en de Gram-negatieve bacteriecel geeft een roze kleur. Dit verschil wordt veroorzaakt door de dikte van de celwand (peptidoglycaanlaag). Deze is bij de positieve bacteriën dikker dan bij de negatieve bacteriën en is hierdoor ondoordringbaar voor alcohol. Omdat dit ondoordringbaar is voor alcohol wordt de cel niet ontkleurd en blijft de donkere kleur in de cel hangen. Dit veroorzaakt hierdoor dus ook de paarse kleur. De Gram-negatieve cellen hebben een hele dunne celwand (peptidoglycaanlaag). Hierdoor is het wel doordringbaar voor alcohol en wordt de kleur er weer uitgewassen. Door de nabehandeling met fuchsine ontstaat de rozige kleur aan de Gram-negatieve bacteriën.

Oxidase Test

Bij een oxidase test wordt er gekeken naar de productie van een intracellulair oxidase enzym. In aanwezigheid van zuurstof en cytochroom C zorgt dit enzym voor de oxidatie van fenyleendiamine dat aanwezig is in het reagens. Door de oxidatie ontstaat er een blauwe kleur bij een positieve reactie. Ook zit er ascorbinezuur in het reagens om auto-oxidatie te voorkomen.

Katalase Test

Katalase is een enzym dat aanwezig is in aerobe micro-organismen. Het enzym zorgt ervoor dat waterstofperoxide wordt gesplitst in water en zuurstof. Een katalase test is eenvoudig uit te voeren door waterstofperoxide toe te voegen aan enkele kolonies. Bij een positieve reactie zullen er vrijwel direct gasbellen te zien zijn.

Coagulase Test

Coagulase is een enzym dat fibrinogeen omzet in fibrine. Als dit gebeurt dan geeft de test een positief resultaat. Er zal dan klontering te zien zijn op de teststrip.

Analytical profile index (API)

Voor de identificatie van bacteriën wordt tegenwoordig gebruik gemaakt van mini biochemische identificatiesystemen, ook wel analytical profile index of API. Een API is een strip die een biochemische reeks bevat, waar voor elke bacterie specifieke resultaten uitkomen. Een voordeel hiervan is dat de bacterie op een snelle en betrouwbare manier geïdentificeerd kan worden. Ook kunnen er veel biochemische testen tegelijk worden uitgevoerd. In dit onderzoek wordt er gebruik gemaakt van een API 20 A om P. gingivalis te identificeren en van een API Strep om S. mutans te identificeren.

De API 20 A is een biochemische reeks die bedoeld is voor de identificatie van anaeroob groeiende bacteriën. De strip bestaat uit 20 testen. De reactietijd van deze testen is 24 tot 48 uur, maar een incubatie van 24 uur op 36⁰C zou genoeg moeten zijn voor een duidelijk resultaat. API Strep is een biochemisch reeks die bedoeld is voor de identificatie van streptococcus. Deze strip bevat 20 testen en moet 72 uur geïncubeerd worden. Met en API Strep kunnen tot wel 84 verschillende soorten geïdentificeerd worden.

Moleculairbiologisch onderzoek

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Polymerase Chain Reaction (PCR) is een manier om DNA te amplificeren. Dit houdt in dat een enkele streng DNA verdubbeld wordt. In de volgende ronde van het proces worden de twee eerder gevormde strengen beide verdubbeld, waardoor er vier strengen ontstaan. Zo gaat het verder tot er een miljard kopieën zijn van de originele DNA streng. Om dit te kunnen waarmaken zijn er een aantal onderdelen nodig nodig. Ten eerste het DNA dat verdubbeld dient te worden. Verder zijn er o.a. primers (deze binden op een specifiek deel van het DNA, ze vormen ook het begin van een nieuwe streng), dNTP’s (Dit zijn losse stukjes DNA oftewel losse nucleotiden). Tijdens de PCR zijn er drie stappen die continu herhaald worden. Bij de denaturation wordt de mix verhit tot 92⁰C. Bij deze temperatuur ontrafelt DNA, waardoor er twee strengen ontstaan. Vervolgens vindt annealing van de primers plaats. Tijdens deze stap wordt de PCR afgekoeld tot 55⁰C. Op deze temperatuur zijn de primers in staat om te binden aan het gesplitste DNA.

De laatste stap uit deze reeks is de extension. Met de primers in plaats kan de complementaire streng van het DNA gemaakt worden. Dit doet het door één voor één de dNTP’s in de goede volgorde te plaatsen totdat de complementaire streng compleet is. Wanneer alle stappen eenmaal afgerond zijn, is de eerste cyclus voltooid en hierna begint het herhalingsproces.

Identificatie door het vergelijken van ribosomaal bacterie DNA (16S-rDNA)

Ribosomen (onderdelen van een cel) lezen de genetische code van het DNA, vertalen deze codes en bouwen een eiwit. Een bepaald stuk DNA in het bacterieribosoom is bijzonder geschikt voor de analytische microbiologie. Het heet 16S-rDNA, waarbij de kleine r staat voor ribosomaal, en komt alleen in bacteriecellen voor.
De basenvolgorde in de genen van het rDNA zijn gedurende de evolutie maar weinig veranderd. De relatief zeldzame veranderingen die wel hebben plaats gevonden kunnen nu gebruikt worden om het verwantschap van de bacteriën onderling vast te stellen en ook om de soort (of stam) zelf te herkennen.

Om nu de 16S rDNA te vinden worden er universele primers gebruikt. Dat kan alleen maar als de basenvolgorde complementair is aan de volgorde van het gezochte stukje. Doordat deze universele primers bekend zijn wordt het ook bekend hoe de onbekende streng van het DNA in elkaar zit. Dan wordt de basenvolgorde van het 16S rDNA van het tandplakmonster vergeleken met de opgeslagen codes in databases met bekende bacteriën om de bacteriesoort vast te stellen.